?
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽(yáng)性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
BGPNα-苯甲酰-L-精氨酸 98.5%葛根素 98%

α-Glycerophosphate disodium salt hexahydrate4-硝基-L-苯氨酸 98%黃藤素 97%

DL-α-Glycerol phosphate magnesium salt hydrate4-硝基-D-苯氨酸 99%擬人參皂苷F11 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

Paraffin oil4-硝基-DL-苯氨酸 98%安石榴苷  98%

Lileic acidNeuromedin C ≥97% (HPLC)根皮苷,二 98%

Oleic acid美拉諾坦 ≥95% (HPLC)異槲皮苷 98%

5-FOAD-鳥氨酸鹽酸鹽 99%D-(-)-奎尼酸 98%

Shikimic acidN'-Cbz-L-鳥氨酸 98%金絲桃苷 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%

Palmitoleic acidL(+)-2,3-二氨基氨酸鹽酸鹽 97%槲皮素 97%

CyDTAL-鳥氨酸鹽酸鹽 98%白藜蘆 99%

PABAN-叔丁氧羰基-N'-芐氧羰基-D-鳥氨酸  98%吳茱萸次堿 98%

PABA sodium saltN-芴甲氧羰基-(N'-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)己-1-亞基)乙基)-LL-鼠李糖，一 99%

4-Amibenzenesulfonic acidL-鳥氨酸甲酯  99%(+)-蕓香苷，三 97%

Maleic acid5′-O-(4,4′-二甲氧基三苯甲基)胸苷 98.0%迷迭香酸 97%

Maleic acid sodium saltOxime Resin 0.3~0.8mmol/g, 100~200 mesh, 1% DVB左旋延胡索乙素 分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥98%（HPLC)

Sulfamic acidOrexin A human, rat, mouse ≥97% (HPLC)紅景天苷  分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥97.5%(HPLC)

2-甲基四(MeTHF)(Standard for GC,≥99.5%(GC))Brg1 (P680) AntibodyMenin/Men1  Menin抑癌蛋白抗體

異戊烷(Standard for GC,≥99.7%(GC))MLH1 (4C9C7) Mouse mAbmembrane glycoprotein E(VZV)  人痘帶狀皰疹病毒gE蛋白抗體

烯酸甲酯（MA）(Standard for GC,>99%(GC))MLH1 (4C9C7) Mouse mAbMelama HMB45/Melama/Melan-A/MART-1  黑色素瘤相關(guān)抗原/黑色素-A抗體

丁酸甲酯(Standard for GC,>99.5%(GC))Phospho-NPM (Thr95) AntibodyMelamine(1B12)  三聚胺單克隆抗體

α-甲基烯酸(Standard for GC)Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (PE Conjugate)Melamine  三聚胺抗體

乙二甲(standard for GC,>99.7%(GC))Phospho-Keratin 17 (Ser44) AntibodyMelamine  三聚胺抗體

N-甲基吡咯烷酮（NMP）(standard for GC,≥99.6%(GC))Phospho-NPM (Ser4) (D19C1) XP® Rabbit mAbMelamine  三聚胺抗體

異丁(standard for GC,≥99.5%(GC))Phospho-NPM (Ser4) (D19C1) XP® Rabbit mAbMel18/ZNF144  鋅指蛋白蛋白144抗體

甲基環(huán)己烷(Standard for GC,≥99.8%(GC))Phospho-MDM2 (Ser166) AntibodyMEK6  絲裂原活化蛋白激酶MKK6抗體

乙酸甲酯(GCS,≥99.9% (GC))Phospho-PNK1 (Ser114/Thr118) AntibodyMEK5/MAP2K5  絲裂原活化蛋白激酶激酶5抗體
假結(jié)核耶爾森菌PCR檢測(cè)試劑盒說明書G蛋白偶聯(lián)受體GPR91蛋白抗體Taxoquine中文名：別名：分子式：C20H28O4

特異性囊腫病液體蛋白15抗體Danshenxinkun A中文名：丹參新醌甲別名：Danshexinkun A分子式：C18H16O4

生長(zhǎng)抑制DNA損傷基因GADD45β抗體Przewaquine A中文名：紫丹參甲素別名：分子式：C19H18O4

G蛋白偶聯(lián)受體39抗體Deoxyneocryptotanshine中文名：別名：分子式：C19H22O3

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制蛋白22抗體（甲基化控制J蛋白）甾體